Durch­fluss-Zy­to­me­trie

Durchfluss-Zytometer (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, K. Matthes)
Das Durchfluss-Zytometer BD Influx Mariner (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, K. Matthes)

Was ist Durch­fluss-Zy­to­me­trie?

Durch­fluss­zy­to­me­trie er­laubt das Mes­sen ver­schie­de­ner Ei­gen­schaf­ten ein­zel­ner Zel­len in ei­nem Was­ser­strahl. Am Max-Planck-In­sti­tut für Ma­ri­ne Mi­kro­bio­lo­gie nut­zen wir die Durch­fluss­zy­to­me­trie ei­ner­seits, um die An­zahl von Zel­len in See­was­ser­pro­ben und in Zell­kul­tu­ren fest­zu­stel­len. An­de­rer­seits kön­nen wir mit der Tech­nik Zel­len mit ho­her Ge­schwin­dig­keit und in ho­her Rein­heit ge­mäß ih­rer Ei­gen­schaf­ten sor­tie­ren, um sie im An­schluss wei­ter mo­le­ku­lar­bio­lo­gisch zu ana­ly­sie­ren.

Für die mo­le­ku­lar­bio­lo­gi­sche For­schung stellt die Durch­fluss­zy­to­me­trie eine wich­ti­ge Er­gän­zung dar. Die Mög­lich­keit, Tau­sen­de von Zel­len pro Se­kun­de zu ana­ly­sie­ren und gleich­zei­tig mul­ti­ple Pa­ra­me­ter wie die Fluo­res­zenz von Pho­to­syn­the­se­pig­men­ten oder spe­zi­fi­schen Fluo­res­zenz­farb­stof­fen auf­zu­neh­men, macht die Durch­fluss­zy­to­me­trie zu ei­nem Stan­dard­werk­zeug in der Plank­ton­for­schung. Zu­sätz­lich lässt das durch­fluss­zy­to­me­tri­sche Sor­tie­ren eine phy­si­ka­li­sche Tren­nung und kul­ti­vie­rungs­un­ab­hän­gi­ge An­rei­che­rung von wohl­de­fi­nier­ten Zell­po­pu­la­tio­nen zu.

Die Durch­fluss­zy­to­me­trie ist am Max-Planck-In­sti­tut für Ma­ri­ne Mi­kro­bio­lo­gie eine ei­ge­ne Ar­beits­grup­pe. Dort ver­bes­sern wir stän­dig un­se­re durch­fluss­zy­to­me­tri­schen Me­tho­den und ver­knüp­fen sie mit neu­en mo­le­ku­lar­bio­lo­gi­schen An­sät­zen, um tie­fe­re Ein­bli­cke in die je­wei­li­ge öko­lo­gi­sche Rol­le von Mi­kro­or­ga­nis­men in ver­schie­de­nen ma­ri­nen Ha­bi­ta­ten zu ge­win­nen.

Wie funk­tio­niert die Durch­fluss-Zy­to­me­trie?

Durchfluss-Zytometrie (Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, B. Fuchs)
Prinzip der durchflusszytometrischen Analyse und Sortierung
(© B. Fuchs, Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie)

Bei der Durch­fluss­zy­to­me­trie wird die Pro­be mit den Zel­len in die Mit­te ei­nes kon­ti­nu­ier­lich flie­ßen­den Was­ser­strahls (auch Hüll­flüs­sig­keit ge­nannt) in­ji­ziert. Im wei­te­ren Ver­lauf wird der Was­ser­strahl mit­tels ei­ner Düse auf ei­nen Durch­mes­ser von we­ni­ger als 1/​10 Mil­li­me­ter ver­jüngt. Die ein­ge­schlos­se­nen Zel­len wer­den da­durch in die Mit­te des Was­ser­strahls fo­kus­siert und ver­las­sen die Düse wie Per­len auf ei­ner Schnur. Die ex­akt aus­ge­rich­te­ten Zel­len pas­sie­ren den La­ser­strahl ein­zeln im Be­ob­ach­tungs­punkt und kön­nen so vom La­ser­licht an­ge­regt wer­den. Je nach Grö­ße und Fär­bung der Zel­le wer­den die Licht­si­gna­le der Zel­len durch Lin­sen (nicht ab­ge­bil­det) auf die De­tek­to­ren fo­kus­siert, dort in elek­tri­sche Si­gna­le um­ge­wan­delt und wei­ter in eine Soft­ware am Rech­ner ein­ge­spielt.

Im Sor­tier­mo­dus kön­nen die Zel­len zu­dem nach be­stimm­ten Ei­gen­schaf­ten ge­trennt wer­den. Da­für le­gen die For­schen­den Be­din­gun­gen fest, die die Zel­len er­fül­len müs­sen. Die Düse schwingt in hoch­fre­quen­ten Schwin­gun­gen, was dazu führt, dass der Was­ser­strahl un­ter­halb des Be­ob­ach­tungs­punk­tes zu de­fi­nier­ten Tröpf­chen ab­reißt. Falls eine Zel­le de­tek­tiert wird, die die vor­ge­ge­be­nen Pa­ra­me­ter er­füllt, wird die ent­spre­chen­de Zel­le mit ih­rem Tröpf­chen elek­trisch ge­la­den. Die ge­la­de­nen Tröpf­chen mit den Zel­len wer­den ge­mäß ih­rer La­dung (po­si­tiv oder ne­ga­tiv) ab­ge­lenkt und lan­den in ei­nem Re­ak­ti­ons­ge­fäß. Ab­ge­bil­det ist hier ein Zwei-Wege-Sor­ter, der zwei Po­pu­la­tio­nen gleich­zei­tig sor­tie­ren kann.

Wir ha­ben am In­sti­tut ak­tu­ell drei ver­schie­de­ne Durch­fluss­zy­to­m­e­ter. Sie un­ter­schei­den sich un­ter an­de­rem in Grö­ße, Sen­si­bi­li­tät und Aus­stat­tung. Alle drei kön­nen trans­por­tiert wer­den und sind für den Ein­satz an Bord von For­schungs­schif­fen ge­eig­net. Wei­te­re In­for­ma­tio­nen gibt es auf der Ab­tei­lungs­sei­te der Forschungsgruppe Durchflusszytometrie.

Die Durch­fluss-Zy­to­me­trie im Ein­satz

Wir kombinieren mehrere Methoden zur spezifischen Anreicherung von Bakterien: (1) Wir färben mit FISH eine bestimmte Bakterienart aus unserer Helgoland-Wasserprobe an. (2) Anhand dieses Signals werden nur hybridisierte (=leuchtende) Zellen mit dem Durchflusszytometer aussortiert. (3) Die DNA dieser Anreicherung wird dann sequenziert und weiter analysiert. (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, A. Grieb)
Wir kombinieren mehrere Methoden zur spezifischen Anreicherung von Bakterien: (1) Wir färben mit FISH eine bestimmte Bakterienart aus unserer Helgoland-Wasserprobe an. (2) Anhand dieses Signals werden nur hybridisierte (=leuchtende) Zellen mit dem Durchflusszytometer aussortiert. (3) Die DNA dieser Anreicherung wird dann sequenziert und weiter analysiert. (© Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, A. Grieb)

Analyse unbekannter Mikroben vereinfacht

Ma­ri­ne Mi­kro­ben mö­gen es, ver­ste­cken zu spie­len. So tau­chen man­che Bak­te­ri­en im­mer wie­der in Pro­ben auf, wol­len aber im La­bor ein­fach nicht wach­sen. Gleich­zei­tig sind es in den Um­welt­pro­ben je­weils zu we­ni­ge, um ihre Iden­ti­tät über eine Gen-Ana­ly­se zu ent­hül­len.

Die Lö­sungs-Idee: Mit ei­nem Durch­fluss­zy­to­m­e­ter die Zel­len der in­ter­es­sie­ren­den Spe­zi­es vor dem Se­quen­zie­ren der DNA aus­sor­tie­ren. So wird die Di­ver­si­tät ge­rin­ger und die ei­gent­lich nicht so häu­fi­ge Spe­zi­es kann sich nicht mehr so gut ver­ste­cken. Die Wis­sen­schaft­le­rin­nen und Wis­sen­schaft­ler mar­kier­ten also mit der FISH-Me­tho­de DNA-Ab­schnit­te der Mi­kro­ben mit fluo­res­zie­ren­den Farb­stof­fen. So kön­nen sie die Bak­te­ri­en er­ken­nen und aus­sor­tie­ren. Al­ler­dings gibt es da­bei zwei Her­aus­for­de­run­gen: Ers­tens muss das Farb­si­gnal sehr stark sein, da­mit die Zel­len wäh­rend des Sor­tie­rens gut zu fin­den sind. Zwei­tens darf aber die DNA durch den Farb­stoff nicht be­ein­träch­tigt wer­den, da sie für eine qua­li­ta­tiv hoch­wer­ti­ge Ge­nom-Ana­ly­se im An­schluss mög­lichst in­takt sein muss.   

Ge­mein­sam mit For­schen­den des Joint Ge­no­me In­sti­tu­te tes­te­te ein Team um Anis­sa Grieb, wie die­ser Ba­lan­ce­akt ge­lin­gen kann. Er­folg hat­ten sie am Ende mit ei­ner kürz­lich ent­wi­ckel­ten Va­ri­an­te der FISH-Me­tho­de, und zwar mit der Hy­bri­di­sie­rungs-Ket­ten­re­ak­ti­on (HCR-FISH), die sie durch An­pas­sung ver­schie­de­ner Pa­ra­me­ter wie der Tem­pe­ra­tur für ihre Zwe­cke op­ti­mier­ten. Zu­nächst ha­ben sie die­se Vor­ge­hens­wei­se mit Rein­kul­tu­ren im La­bor op­ti­miert und an­schlie­ßend er­folg­reich mit den Um­welt­pro­ben ge­tes­tet, die vor Hel­go­land ge­nom­men wur­den.

 

  • Das Paper zum Thema ist hier erhältlich: Grieb A, Bower RM, Oggerin M, Goudeau D, Lee J, Malmstrom RR, Woyke T, Fuchs BM. 2020. A pipeline for targeted metagenomics of environmental bacteria. Microbiome 8:21 https://doi.org/10.1186/s40168-020-0790-7

 

 

Wer nutzt die Durch­fluss-Zy­to­me­trie?

Wis­sen­schaft­le­rin­nen und Wis­sen­schaft­ler der Abteilung Molekulare Ökologie. Sie steht aber auch an­de­ren For­schen­den des In­sti­tuts of­fen so­wie ex­ter­nen For­schen­den im Rah­men von Ko­ope­ra­ti­ons­pro­jek­ten.

Kon­takt

Gruppenleiter 

Forschungsgruppe Durchflusszytometrie

PD Dr. Bernhard Fuchs

MPI für Marine Mikrobiologie
Celsiusstr. 1
D-28359 Bremen

Raum: 

2222

Telefon: 

+49 421 2028-9350

PD Dr. Bernhard Fuchs
 
 
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